Preuve structurelle des intermédiaires lors de la formation d'O2 dans le photosystème II

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Preuve structurelle des intermédiaires lors de la formation d'O2 dans le photosystème II

Nature tome 617, pages

Nature volume 617, pages 629–636 (2023)Citer cet article

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Dans la photosynthèse naturelle, la division de l'eau par la lumière en électrons, protons et oxygène moléculaire constitue la première étape du processus de conversion de l'énergie solaire en énergie chimique. La réaction a lieu dans le photosystème II, où le cluster Mn4CaO5 stocke d'abord quatre équivalents oxydants, les états intermédiaires S0 à S4 dans le cycle de Kok, générés séquentiellement par des séparations de charges photochimiques dans le centre de réaction, puis catalyse la chimie de formation de liaisons O–O1, 2,3. Ici, nous rapportons des instantanés de la température ambiante par cristallographie aux rayons X femtoseconde en série pour fournir des informations structurelles sur l'étape de réaction finale du cycle d'oxydation photosynthétique de l'eau de Kok, la transition S3→[S4]→S0 où l'O2 est formé et l'horloge d'oxydation de l'eau de Kok est réinitialisée. . Nos données révèlent une séquence complexe d'événements, qui se produisent sur des micro-à des millisecondes, comprenant des changements au niveau du cluster Mn4CaO5, de ses ligands et des voies de l'eau ainsi qu'une libération contrôlée de protons à travers le réseau de liaisons hydrogène du canal Cl1. Il est important de noter que l'atome O supplémentaire Ox, qui a été introduit comme ligand de pont entre Ca et Mn1 lors de la transition S2 → S34,5,6, disparaît ou se déplace parallèlement à la réduction de Yz à partir d'environ 700 μs après le troisième flash. Le début de l'évolution de l'O2, comme indiqué par le raccourcissement de la distance Mn1-Mn4, se produit à environ 1 200 μs, signifiant la présence d'un intermédiaire réduit, éventuellement un peroxyde lié.

La cristallographie aux rayons X femtoseconde en série aux lasers à électrons libres à rayons X (XFEL)7 nous a permis de collecter des données de cristallographie du photosystème II (PS II) en temps réel au fur et à mesure que la réaction progresse à température physiologique. La réaction d'oxydation de l'eau induite par quatre photons dans PS II (Fig. 1a, b) a été initiée avec plusieurs flashs laser visibles. En utilisant cette capacité, des structures intermédiaires à l'état S (S0, S1, S2 et S3) ont été étudiées4,5,8,9,10 qui ont révélé les changements structurels du complexe évoluant l'oxygène (OEC) de PS II, qui est un unité composée du cluster Mn4CaO5 et de son environnement eau-ligand (Fig. 1c, d)2,11. Récemment, nous avons collecté des données instantanées à plusieurs moments au cours de la transition S2 → S3, l'étape au cours de laquelle une eau de substrat est introduite dans le cluster. L'étude6 a suggéré la séquence d'oxydation de Mn, l'incorporation d'un pont d'oxygène supplémentaire (Ox ou O6 dans Suga et al.10) entre le site de coordination ouvert à Mn1 et Ca (formant Mn4CaO5-Ox dans S3), la voie d'entrée potentielle pour le substrat l'eau et la libération de protons avec son mécanisme de déclenchement6,12. Les études XFEL ont également clairement établi que la structure électronique et géométrique de l'OEC obtenue par ces mesures n'est pas affectée par les photoélectrons X dans les conditions utilisées6,8,13.

a, La structure de PS II avec les hélices intégrées à la membrane et les régions extrinsèques membranaires du côté luminal de PS II représentées en gris. Les principaux composants de transfert d'électrons sont représentés en couleur, qui comprennent les chlorophylles du centre de réaction (P680), les phéophytines, les quinones accepteurs QA et QB, la tyrosine redox-active Yz et le cluster catalytique Mn4CaO5. Le cluster Yz et Mn4CaO5 sont les cofacteurs du site donneur d'électrons. b, cycle de Kok de la réaction d'oxydation de l'eau se déroulant sur le site donneur qui est séquentiellement entraîné par des séparations de charge dans le centre de réaction P680 induites par l'absorption de photons (éclairs lumineux nanosecondes, 1F-4F) dans le système d'antenne du PS II. Les données de cristallographie aux rayons X à température ambiante ont été recueillies aux moments indiqués au cours de la transition S3 → S0. c,d, La structure de l'OEC dans les états S3 (c) et S0 (d) et la séquence d'événements se produisant entre eux. Mn, violet ; Ca2+, vert ; O, rouge. W1, -2, -3 et -4 sont des ligands aqueux de Mn4 et Ca. Les canaux pertinents pour le transfert d'eau et de protons (O1, O4 et Cl1) sont indiqués respectivement par des zones ombrées en rouge, bleu et vert. Les cercles pointillés marquent les différences structurelles entre les états S3 et S0.

Dans la présente étude, nous étudions l'étape de dégagement d'oxygène du cycle d'oxydation de l'eau de Kok (Fig. 1b), la transition S3 → [S4] → S0 (Fig. 1c, d). Dans les échantillons PS II adaptés à l'obscurité, cette transition est initiée par le troisième flash laser visible. L'OEC est oxydé dans cette étape de l'état tout-Mn(IV) S3 à l'état S4 hautement réactif proposé avec des états d'oxydation formels de Mn(IV)4O⦁ ou Mn(IV)3(V). Cela initie la formation de liaisons O – O et la libération d'O2, et le site de liaison maintenant vacant est rempli par un nouveau substrat d'eau formant l'état d'oxydation le plus bas du cluster (S0). Ce processus en plusieurs étapes, qui implique également la libération de deux protons, a la constante de temps la plus longue parmi les transitions d'état S, et sa cinétique dépend de l'espèce et de la préparation de l'échantillon14,15,16,17,18,19.

Pour fournir un aperçu structurel de cette étape de réaction complexe et plus particulièrement de l'interaction importante entre le cluster Mn4CaO5 et son environnement protéine-eau (Fig. 1c, d), nous avons collecté des données de cristallographie à température ambiante de PS II à sept moments différents au cours de la S3. → Transition S0, allant de 50 μs à 4 ms après l'initiation de cette transition (Fig. 1b). Tous les ensembles de données ont des résolutions comprises entre 2,00 et 2,16 Å (tableaux de données étendus 1 et 2).

L'état S3 a été peuplé par l'illumination de microcristaux de PS II adaptés à l'obscurité avec deux flashs laser nanosecondes visibles in situ (2F sur la Fig. 1b) 4, dans lesquels l'intervalle entre les flashs était de 200 ms pour tenir compte de la cinétique QA et QB de l'accepteur quinone et conduire efficacement les transitions d'état S. Les points temporels entre les états S3 et S0 ont été générés en donnant le troisième flash laser de pompe visible à différents temps de retard (Δt) avant que les cristaux ne soient exposés à l'impulsion femtoseconde XFEL (les étiquettes de temps sur la figure 1b). Alors que notre protocole d'éclairage atteint les populations les plus élevées possibles d'états S particuliers, il y a un mélange plus élevé de populations d'états S avec un nombre de flash croissant en raison d'inefficacités intrinsèques spécifiques à PS II ("manque") (Méthodes)20. Nous modélisons cette distribution dans un modèle multicomposant lors du raffinement structurel, la composante « primaire » étant les centres qui passent de l'état S3 à S0. Les composantes « secondaire » et « tertiaire » sont les points de départ et d'arrivée connus : par exemple, la population S3 décroissante et, à des temps de retard plus longs, la population S0 croissante des centres qui ont terminé la transition (les méthodes et le tableau de données étendu 3 ont des détails ). Nous notons que la composante principale à chaque instant peut consister en un mélange de plusieurs structures, qui sont des intermédiaires entre S3 et S0. Tous les résultats discutés ci-dessous correspondent à ces composants primaires raffinés du monomère I (chaînes annotées en majuscules dans les structures déposées).

La figure 2 montre la densité de la carte d'omission des atomes sélectionnés à l'OEC et son environnement de la population raffinée aux points temporels (Δt = 250, 500, 730, 1 200 et 2 000 μs) après le troisième flash (nous utilisons la nomenclature de 3F( Δtμs)). Pour visualiser la séquence des événements lors de la transition S3→[S4]→S0, nous suivons les changements dans trois domaines : Yz et D1-H190 (Fig. 2a,b) et Ox et O5 (Fig. 2c), ainsi que les ligands d'eau W1 – W4 (Fig. 2d) et deux ligands carboxylates du cluster Mn4CaO5 / Mn4CaO5-Ox qui font le pont entre Mn et Ca (Fig. 2e). De plus, les changements de distance atomique sélectionnés sont illustrés à la Fig. 3, y compris les données de point de temps antérieures (50 μs) et ultérieures (4 000 μs).

a, Résidus D1-Y161 (Yz) et D1-H190. La carte d'omission de la référence d'état S3 est affichée en marron clair pour comparaison avec les données de point de temps (bleu). b, Une représentation simplifiée des changements structurels observés dans la région Yz. c, Omettre la densité des atomes O5 et Ox de l'OEC. d, omettre la densité des atomes O5 et les ligands d'eau terminaux W1, W2, W3 et W4 de l'OEC. e, omettre la densité des atomes d'oxygène carboxylate de D1-E189 et D1-D170. Toutes les cartes d'omission présentées dans a et c–e ont été générées en omettant l'atome ou le résidu d'intérêt individuellement, et seul le composant principal (c'est-à-dire l'état qui progresse vers S0) a été utilisé. Les caractéristiques notables sont mises en évidence par des flèches rouges et un cercle pointillé noir. Toutes les cartes d'omission présentées sont profilées à 2,5 σ, 3 σ et 4 σ en utilisant le schéma de couleurs annoté en d pour une visualisation plus facile. Voir également la vidéo d'informations supplémentaires 1.

Toutes les distances sont extraites de la composante raffinée de chaque instant (c'est-à-dire l'état qui progresse vers l'état S0). Les barres d'erreur sont calculées à partir de l'approche fin/rapide décrite dans Méthodes et constituent une limite supérieure. Les données ici sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart type. Les barres d'erreur pour chaque point dans le temps ont été obtenues à partir de n = 100 raffinements END/RAPID indépendants. Plus de détails sur la procédure END/RAPID peuvent être trouvés dans Méthodes. Les flèches en pointillés dans les schémas de l'OEC à droite indiquent l'emplacement des distances individuelles. Mn est représenté par des sphères violettes et O est représenté par des sphères rouges.

La distance entre Yz et D1-H190 a été établie précédemment comme étant un indicateur de l'état d'oxydation de Yz6. A l'état réduit, une forte liaison hydrogène entre Yz et D1-H190 conduit à une courte distance d'environ 2,6 Å. Lors de l'oxydation de Yz par P680 +, le proton phénolique de Yz est transféré à D1-H190, la distance augmente à 2, 8 Å et un mouvement du plan de l'anneau His est observé (Fig. 2b). Nos données montrent que la distance augmente déjà entre les données S3 et le premier point dans le temps (50 μs), indiquant que Yz est complètement oxydé à ce moment (Fig. 3). Par la suite, cette distance reste constante jusqu'à 500 µs et revient au niveau de base entre 730 et 1200 µs. Ainsi, les données démontrent que la réduction de \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) par le cluster Mn4CaO5-Ox ne commence qu'après environ 500 μs (Tableau de données étendu 4)16,21,22 et semble être complet au point temporel de 1 200 μs. Des changements de distance supplémentaires entre Yz et His190 sont observés à 2 000 et 4 000 μs, ce qui peut être dû au réarrangement du réseau de liaisons hydrogène lié à la dernière libération de proton mais qui n'est pas bien compris actuellement. Fait intéressant, un changement de position d'un résidu Tyr à côté de la paire spéciale Chl lors d'une excitation lumineuse a déjà été noté dans les données de cristallographie résolue en temps du centre de réaction bactérien violet et interprété comme provenant d'un changement dans les interactions de liaison hydrogène de ce Tyr lors de la déprotonation23.

L'oxygène supplémentaire Ox, présent à l'état S3, est perdu lors de la formation de S0, ce qui indique que Ox peut participer à la formation de la liaison O – O, et les changements de sa densité informent probablement sur le début de ce processus. Pour tracer la population Ox, Ox a été éliminé du modèle OEC et sa densité de carte d'omission est illustrée à la Fig. 2c. O5 a été omis séparément, permettant la comparaison de leurs densités (voir également Données étendues Fig. 1). La densité d'omission Ox devient asymétrique à partir de 250 μs, avec une nette diminution d'intensité après 500 μs et descendant jusqu'au niveau de bruit entre 1 200 et 2 000 μs, et Ox ne peut être modélisée qu'avec une population inférieure à 20 % dans les 2 000 μs point de temps. Les changements d'intensité Ox se produisent simultanément avec la réduction de \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\), indiquant que la formation de la liaison O–O se produit entre 500 et 1 200 μs. Pendant toute la transition S3→[S4]→S0, la densité de O5 reste approximativement constante, à l'exception d'une diminution de sa densité électronique à 1 200 μs.

Des marqueurs supplémentaires de la présence de Ox dans le cluster sont les distances Mn – Mn. Comme indiqué précédemment, la distance Mn1 – Mn4 augmente pendant la transition S2 → S3 en raison de l'insertion de Ox (réf. 6). La figure 3 montre que la distance Mn1 – Mn4 reste allongée dans les structures 3F jusqu'à 1 200 μs (Methods a une analyse plus détaillée) puis diminue au cours des 3 ms suivantes pour atteindre la même valeur que celle observée dans les états S1 et S2. Une tendance similaire est également observée dans la distance Mn1–Mn3. Ainsi, il existe un délai entre le début de la formation de la liaison O – O (500 à 730 μs sur la base des changements observés pour Yz et Ox) et le moment où les distances Mn – Mn commencent à diminuer (1 200 μs). La découverte indique que pendant cette période, un intermédiaire d'oxydation de l'eau existe probablement avant la libération d'O2.

Des changements de forme et d'intensité sont observés pour la densité de la carte d'omission des ligands d'eau W1 – W4, qui sont affichés sur la figure 2d. En effet, un léger allongement de la densité O5 vers W2 et un léger allongement de la densité W4 vers W3 sont observés à 250 μs. Cette dernière tendance se poursuit, et à 500 μs, on observe un chevauchement des densités W3 et W4, avec un pic mFobs − DFcalc (Fobs et Fcalc sont respectivement les facteurs de structure expérimentale et modèle, tandis que m et D sont des facteurs de pondération) à 2,5 σ entre W3 et W4 (Extended Data Fig. 2). Au même moment, la densité de W1 s'étend vers D1-D61 et W19, indiquant une mobilité plus élevée de W1. Nous supposons que tous ces mouvements sont liés à la déprotonation de l'OEC et au transfert de protons vers le canal Cl1 (voir la section suivante et la figure 4).

a, Le terminus du canal O1 près de l'OEC qui comprend le groupe de cinq eaux (W26–W30) dans cette région. La carte de densité électronique 2mFobs - DFcalc est superposée à 0,8 σ, 1,0 σ et 1,5 σ. b, Les canaux O4 et Cl1 (branche A) qui incluent la région D1-D61 et D1-E65/D2-E312 qui est suggérée pour fonctionner comme une porte proton. Superposés sont mFobs - DFcalc omettre les cartes pour W1, W2 et D61 montrées à 2.5σ, 3.0σ et 4.0σ. La carte de densité de différence Fobs (point temporel) - Fobs (2F) dans un rayon de 1,5 Å de W19/W20/W48 dans le canal O4 à 3σ (carte orange) est également illustrée. L'angle de rotation observé au niveau de la chaîne latérale de E65 à des instants particuliers est calculé par rapport à la position correspondante de la chaîne latérale à l'état 2F. Les modifications majeures sont mises en évidence par une flèche ou un cercle en pointillés. Toutes les eaux sont colorées par leurs facteurs B selon le schéma de couleurs divergentes illustré sur la figure. Les interactions importantes des liaisons hydrogène sont affichées avec un schéma de couleurs binaires pour indiquer la force (la distance <2,8 Å est rouge et 2,8–3,2 Å est grise).

A 730 μs, les densités O5, W2 et W3 deviennent anisotropes, pointant toutes vers une région entre ces trois atomes d'oxygène (Fig. 2d), ce qui indique une mobilité accrue de ces ligands. Dans le même temps, la densité Ox est également fortement anisotrope. Ce mouvement des quatre atomes d'oxygène est probablement lié à la formation de l'intermédiaire d'oxydation de l'eau. Nous notons qu'une modélisation précise de la position Ox nécessitera des données à plus haute résolution. À 1 200 μs, les densités de tous les ligands d'eau terminaux (W1 – W4) et du pont O5 deviennent les plus faibles. Une comparaison de ces densités de carte d'omission au sein de l'OEC avec celle de l'atome O2, dont on pense qu'il ne joue pas un rôle prédominant dans l'étape S3→S0, montre que la réduction de la densité est spécifique à ces cinq atomes (W1–W4 et O5) et Ox (données étendues Fig. 1). Le recouvrement des densités O5, W2 et W3 n'est plus observé à 1200 μs.

À 2 000 μs après le troisième flash, la densité de la carte d'omission O5 est considérablement restaurée par rapport aux états S3 et S0, mais les densités de carte d'omission des eaux W1 à W4 n'ont pas encore atteint un niveau similaire et restent allongées. Nous notons un chevauchement similaire de W1/W2 comme observé à 500 μs. Cela pourrait indiquer le début de la deuxième libération de protons, connue pour se produire dans la transition S3→S0, après la liaison d'une eau qui remplit le site vacant formé par la libération d'O221,24,25. Fait intéressant, la forme allongée de la densité W3 persiste même à l'état S0, que nous avons modélisé précédemment avec deux positions possibles de W3 (réf. 4).

La figure 2e montre que les ligands D1-D170 et D1-E189, qui font tous deux un pont entre un Mn et Ca, changent de conformation pendant la formation et la libération d'O2. Conformément à la mobilité élevée observée pour les ligands d'eau W1 et W2, la connexion entre D1-D170 et Ca semble être affaiblie entre 730 et 2 000 μs et n'est entièrement restaurée qu'à l'état S0 (3F(200 ms)).

De 1 200 à 4 000 μs, plusieurs changements structurels se produisent, qui s'inversent lors de la formation de l'état S0 stable (3F(200 ms)). Celles-ci incluent l'augmentation des distances Yz–D1-H190, Ca–D1-E189 et Mn4–O5, ainsi qu'une diminution des distances Mn1–Mn4 et Mn1–Mn3. La plupart de ces changements indiquent la libération d'O2 et/ou l'insertion d'eau via l'ion Ca26,27, éventuellement à partir du canal O1 (voir ci-dessous). Cela indique que la libération d'O2 et le remplissage du cluster par de l'eau en vrac et la réinitialisation du centre catalytique se produisent sur une échelle de temps prolongée.

PS II a plusieurs canaux hydrophiles qui s'étendent de l'OEC au côté lumenal de la membrane thylakoïde11,28,29,30,31, et certains d'entre eux sont proposés pour jouer un rôle critique dans le transport des protons et des eaux du substrat pendant le cycle catalytique ( Les canaux O1, O4 et Cl1 sont représentés sur la Fig. 1)24,32,33. Dans notre étude récente de la transition S2→S312, nous avons attribué au canal O1, qui s'étend de O1 et Ca de l'OEC à la masse, un canal d'eau de substrat et le canal Cl1, qui s'étend de W1 et W2 de la OEC au volume, pour être un canal de libération de protons lors de la transition S2→S36. La transition S3→S0 implique également l'insertion d'une eau de substrat dans l'OEC et la libération de deux protons dans la masse ; il a été suggéré qu'un proton est libéré avant la formation de la liaison O – O et l'autre après la reliure d'une molécule d'eau à l'OEC24,25,34.

La figure 4 montre les données temporelles pour les canaux O1 et Cl1/O4 près de l'OEC pendant la transition S3→S0. La densité électronique des molécules d'eau dans le canal O1 au voisinage de l'OEC change considérablement, comme le montrent les cartes 2mFobs - DFcalc (Fig. 4a), similaire à ce qui a été observé lors de la transition S2 → S36. Les eaux W27, W28 et W32 (le tableau supplémentaire 1 a une numérotation de l'eau) ont une faible densité électronique et des facteurs B élevés (environ 50 Å2) (données étendues Fig. 3) par rapport aux eaux plus stables, telles que W29 (facteur B d'environ 37 Å2), en particulier à 1200 μs. Nous interprétons cela comme une indication de la grande mobilité de ces eaux et émettons l'hypothèse que cette région pourrait servir d'entrée pour l'eau du substrat qui remplit l'OEC après la libération d'oxygène moléculaire12. Nous proposons donc que PS II utilise le canal O1 pour l'apport de substrat dans les transitions S2 → S3 et S3 → S0. Parmi le groupe de cinq eaux (W26–30) («roue hydraulique» dans la réf. 6), W26 montre une densité électronique élevée tout au long de la transition, avec une densité sensiblement élevée à 500 μs. Comme W26 est à une distance de liaison hydrogène avec O1 de l'OEC, cette interaction peut être importante pour équilibrer la charge sur le cluster, lorsque l'OEC progresse à travers la dernière étape d'oxydation (c'est-à-dire la formation de l'état S4) et la suite à quatre électrons réduction pour former l'état S0.

Des changements sont également observés dans le canal Cl1. À 250 μs, le résidu D1-E65 tourne de 19 ° vers W40, ce qui réduit la distance entre D1-E65 et W40 de 0, 3 Å (Fig. 4b). C'est le moment où la densité Ox commence à devenir asymétrique, ce qui est encore plus prononcé à 500 μs (Fig. 2c). À 500 μs, la densité de la carte d'omission W1 s'allonge également vers la région de D1-D61 et W19 (Fig. 4b). Cela coïncide avec une diminution de la densité d'oxygène du carboxylate D1-D61 qui se situe dans la distance de liaison hydrogène de W40 et un raccourcissement de la distance entre W40 et D1-E65 de 0,5 Å en raison de la rotation (25°) de la chaîne latérale. Par conséquent, un réseau continu de liaisons hydrogène est formé qui relie l'OEC à la région D1-E65/D2-E312. Nous supposons que les changements sont liés au premier transfert de protons de l'OEC vers le canal Cl1. Ces changements sont inversés au point temporel de 730 μs (Fig. 4b). Un événement de déprotonation précoce a également été suggéré par d'autres études utilisant différentes méthodes, avec des constantes de temps allant de 50 à 300 μs (c'est-à-dire avant le dernier événement d'oxydation ; la formation de l'état transitoire S4)15,16,17,21,24 ,34,35.

À 1 200 μs, le résidu D1-E65 tourne vers W40 pour la deuxième fois au cours de cette transition, accompagné d'un raccourcissement de la distance W42-D1-E65 de 0,4 Å. Ainsi, un réseau de liaisons hydrogène de l'OEC à la région D1-E65/D2-E312, similaire à ce que nous avons observé à 500 μs, se reforme à ce moment. La distance D1-E65/D2-E312 s'allonge d'environ 2,6 à environ 3,2 Å, ce qui indique un affaiblissement substantiel de l'interaction, formant probablement une configuration pouvant accepter le prochain proton. Ce changement coïncide avec le moment où la densité électronique Ox diminue en dessous du niveau de détection dans la carte d'omission (Fig. 2) et les densités W28, W27 et W32 diminuent dans le canal O1 (Fig. 4a). Nous interprétons cette série de changements comme étant liée au début du processus de récupération du cluster Mn4CaO5 (c'est-à-dire initié par l'insertion d'eau dans l'OEC avec une déprotonation). À 2 000 et 4 000 μs, la chaîne latérale de D1-E65 est tournée de près de 40 ° de sa position dans la structure S3 vers W119 (Fig. 4b). La distance D1-E65–W119 est d'environ 2,5 Å, suggérant un proton partagé ou une interaction très étroite entre ces deux groupes. D1-R334 se déplace également de 20°, formant une interaction de liaison hydrogène avec W41.

Les changements autour de la région D1-E65/D2-E312 sont révélateurs de la libération de protons dans la masse puisqu'ils rappellent ce que nous avons observé pour la libération de protons lors de la transition S2→S312. Dans la transition S3→S0, nous émettons l'hypothèse que les changements antérieurs de cette région (250–730 μs) sont liés au premier transfert de proton et que les changements ultérieurs (1 200–4 000 μs) sont liés au deuxième transfert de proton de l'OEC au vrac, par D1-D6136,37 via la rotation de D1-E65. Ainsi, le résultat actuel suggère que la région D1-E65/D2-E312 fonctionne comme une porte pour la libération de protons deux fois pendant la transition S3→S0.

W20, qui forme un réseau serré de liaisons hydrogène avec O4 via W19 dans le canal O4, disparaît lors de la transition S1→S2 et réapparaît à l'état S04. Son retour lors de la transition S3→S0 est donc un indicateur du rétablissement complet de l'état S0. La première indication claire du retour de W20 se trouve dans la carte de différence Fobs(4 000 μs) − Fobs(2F) (densité orange sur la Fig. 4b), et elle a été modélisée à 40 % d'occupation dans la composante raffinée de 4 000 μs. Cela implique que la restauration W20 se produit dans la dernière étape de la récupération OEC.

Les instantanés des structures de PS II lors de la transition S3→S0 montrent la séquence et la progression de chacun des événements à plusieurs endroits avec différentes constantes de temps. Les changements structurels peuvent être regroupés en quatre sections avec des temps d'apparition et des cinétiques différents, comme le montre la figure 5 ; ce sont les changements d'état redox de Yz, la première déprotonation, l'oxydation OEC et la formation d'O2 et la récupération complète et la réinitialisation de l'horloge Kok à l'état S0.

La séquence d'événements (i-iv) menant au premier événement de déprotonation, à la libération d'oxygène moléculaire, à l'insertion d'eau et au deuxième événement de déprotonation. Les atomes OEC sont représentés en violet (Mn), vert (Ca) et rouge (O). Le canal O1 est représenté en rouge, le canal O4 est en bleu et le canal Cl1 en vert. Les ligands de l'OEC et les résidus formant les canaux eau-proton sont colorés en fonction de la sous-unité à laquelle ils appartiennent (D1, bleu ; D2, vert). Les voies possibles pour le transfert de protons (flèche cyan), d'eau (flèche pointillée rouge), d'oxygène (flèche pleine rouge) et d'électrons (flèche verte) sont représentées. Les caractéristiques notables sont mises en évidence par des flèches noires. La boîte tan de droite montre les modèles suggérés (modèle a et modèle b) pour la formation de liaisons O – O. L'oxygène surligné en magenta indique les atomes candidats pour la formation de O – O.

Dans l'état S3, les quatre Mn sont formellement à l'état d'oxydation (+IV). Nous notons que l'oxydation du ligand au lieu de Mn (formation d'oxyle ou d'une liaison oxo-oxyle) lors de la transition S2→S3 a été suggérée dans la littérature5, mais cela n'est pas conforme à la spectroscopie d'émission de rayons X à température ambiante (XES ) données, qui montrent l'oxydation de Mn6,13. Au troisième flash, l'oxydation de Yz se produit par don d'un électron à P680+ après la séparation de charge au centre de réaction des chlorophylles. Une augmentation de la distance entre Yz et D1-H190 est observée par rapport à l'état S3 en 3F(50 μs) (Figs. 3 et 5(i)). Ce changement est attribué à la formation \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\), qui est connue pour se produire dans les 30 μs après la photoexcitation38, et la translocation de protons associée entre \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) et D1-H190.

La formation \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) déclenche le premier événement de déprotonation probablement pendant la période de 200 à 500 μs15,16 ,17,24,34,39. Nous avons observé le début de la rotation de D1-E65, qui est proposé pour faire partie de la porte du proton, et la formation de la voie de la liaison hydrogène de l'OEC à cette région à 250 μs. Parallèlement à ces changements, les densités d'électrons à W1 et D61 deviennent plus importantes à 500 μs (Figs. 2d et 4b), potentiellement liées à une libération de protons de l'OEC vers les résidus de grille de protons D1-E65 et D2-E312 (Fig. 5(ii)).

Au début de la période de 500 à 1 200 μs, le dernier événement d'oxydation (formation d'un état transitoire S4, avec Mn(IV)4O⦁ ou Mn(IV)3(V)) se produit, puis la réduction de Mn a lieu (Fig. 5(iii)). La formation de la liaison O – O devrait être déclenchée par cet événement d'oxydation final de l'OEC à l'état S4 potentiellement de courte durée. Le changement de distance que nous observons pour Yz–D1-H190 entre 500 et 730 μs suggère que la réduction de \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox} }\) a lieu pendant ce temps, par le transfert d'électrons de l'OEC vers Yz. Après la formation transitoire de S4, la réduction à quatre électrons peut se dérouler en une étape avec la formation de la liaison O – O et la libération immédiate de O2 ou en deux étapes avec la présence d'un intermédiaire avant la libération d'oxygène moléculaire de l'OEC. Dans ce dernier cas, une espèce peroxo formée par une réduction initiale à deux électrons apparaît très probablement comme un intermédiaire.

Nos données montrent qu'il y a un délai entre le début de la formation de la liaison O–O (500–730 μs) comme indiqué par la distance/rotation Yz–D1-H190 et la diminution de la densité électronique Ox et le début de la libération d'O2 soutenu par la contraction de la distance Mn1–Mn4 (1 200 μs). Ce délai d'apparition de la libération d'O2 est également conforme aux études sur l'évolution de l'O222,40. Le retard indique qu'il existe un état intermédiaire, éventuellement une espèce de type peroxyde, pointant vers le mécanisme de réduction des électrons en deux étapes.

Plusieurs sites de formation de liaisons O–O ont été proposés dans la littérature sur la base d'études théoriques (Fig. 5)3,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Parmi ceux-ci, O5–Ox rend le mieux compte de nos données en raison de leur proximité et de l'occupation réduite d'O5 autour de 1 200 μs (Fig. 5, modèle a). Cependant, deux autres possibilités dans lesquelles O5 réagit avec W2 ou W3 et Ox remplace O5 ne peuvent pas être exclues à ce moment (Fig. 5, modèle b). Alors que d'autres mécanismes qui n'impliquent pas O5 ne peuvent pas être exclus, il n'y a aucune preuve claire pour soutenir ceux dans les données actuelles.

À 1 200 μs, la densité de la carte d'omission d'Ox est inférieure au seuil de 2,5σ, ce qui indique qu'une fraction prédominante d'Ox s'est déplacée de sa position d'origine dans le cluster. La contraction des distances Mn1–Mn4 et Mn1–Mn3 à partir de ce moment suggère que le début de la libération d'O2 se produit à peu près à ce moment. Une fois l'O2 libéré, le remplissage de l'amas avec une nouvelle eau de substrat semble se produire immédiatement. Ceci est basé sur l'observation qu'il n'y a pas de densité d'oxygène manquante en plus de Ox, bien que les densités de la carte d'omission de toutes les eaux terminales (W1–W4) et du pont O5 soient affaiblies à 1 200 μs. Les données confirment que la libération d'O2 et le remplissage du site sont hautement coordonnés et se produisent probablement via une eau terminale déjà liée à l'OEC.

À la fois à 2 000 et 4 000 μs (Fig. 5 (iv)), la densité Ox se situe dans le niveau de bruit, ce qui implique que Mn1 devient principalement à cinq coordonnées. Mn4 est à six coordonnées, bien que l'interaction Mn4–O5 soit faible (2,2–2,3 Å), suggérant que O5 pourrait être un hydroxyde. La distance Ca–D1-E189 est encore plus allongée à ces instants qu'à l'état S0. D'autres récupérations lentes sont observées dans la région Yz (Fig. 2b), la « roue hydraulique » (Fig. 4a) et les régions de la porte des protons (D1-E65/D2-E312) (Fig. 4b). Nous émettons l'hypothèse qu'une eau de la région de la « roue hydraulique » dans le canal O1, similaire à la transition S2→S36,12, remplace le ligand d'eau terminal de l'OEC. Les changements dans la région de la porte du proton pourraient indiquer la déprotonation de l'eau nouvellement insérée36. Simultanément, l'environnement de coordination des acides aminés, le réseau de liaisons hydrogène autour de l'OEC et les eaux dans les canaux se réinitialisent à l'état S0. Cela inclut la récupération de W20 dans le canal O4, qui serait impliqué dans la libération de protons lors de la transition S0→S14,50.

Dans l'étude actuelle, des instantanés de la température ambiante des structures PS II à travers l'étape finale de l'horloge de Kok (S3→[S4]→S0) révèlent les détails des processus moléculaires pour l'oxydation photosynthétique de l'eau. Jusqu'à présent, ces processus étaient interprétés en grande partie sur la base d'études cinétiques. Il est important de noter que les résultats rapportés ici fournissent un support expérimental pour un mécanisme de réduction en deux étapes du cluster Mn4CaO5-Ox lors de la formation de la liaison O – O et de la libération d'O2 avec un intermédiaire transitoire, très probablement un peroxyde lié. Il s'agit d'une avancée majeure vers la compréhension de la chimie de la réaction d'oxydation de l'eau. Les résultats montrent également comment les catalyseurs biologiques, tels que l'OEC dans le PS II, permettent des réactions multiélectrons/multiprotons grâce à l'interaction entre le centre métallique, l'environnement protéique et le réseau hydrique. Le rôle actif du microenvironnement dans les enzymes naturelles fournit une inspiration sur la façon de contrôler ces réactions dans les systèmes photosynthétiques artificiels qui peuvent être fabriqués à partir d'éléments terrestres abondants.

Les mesures de diffraction des rayons X de cristaux de 20 à 60 µm préparés à partir de dimères PS II de Thermosynechococcus vestitus (précédemment nommé Thermosyncechococcus elongatus) ont été réalisées dans 100 mM d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique, pH 6,5, 100 mM de chlorure d'ammonium et 35 % (poids/volume) de PEG 5000 (réf. 51, 52). La suspension de cristaux de PS II, à une concentration de chlorophylle (Chl) d'environ 0, 5 à 1, 2 mM, a été chargée dans une seringue (seringue étanche aux gaz Hamilton, 1 ml) et adaptée à l'obscurité pendant 1 h avant la collecte des données. La spectroscopie de masse à l'entrée de la membrane (MIMS) a été utilisée pour déterminer l'évolution de l'O2, les paramètres de renouvellement et les populations à l'état S4,6. Les cristaux de PS II n'ont montré aucune contamination par le Mn (II) d'après les mesures de XES et de résonance paramagnétique électronique53 et ont présenté une activité de 2500 ± 100 μmol O2 (mg(Chl) × h)−1.

L'éjection acoustique de gouttelettes54 a été utilisée en combinaison avec la méthode de distribution d'échantillons Drop-on-Tape55. Pour capturer les intermédiaires stables S2, S3 et S0, chaque gouttelette de la suspension cristalline a été éclairée par des impulsions laser de 120 ns à 527 nm à l'aide d'un laser Nd: YLF (fluorure de lithium d'yttrium) (Evolution, Coherent) à Linac Coherent Light Source ( LCLS) ou par des impulsions laser de 8 ns à 532 nm en utilisant une combinaison de deux lasers Nd:YAG (yttrium aluminium garnet) (Minilite, Continuum) au Spring-8 Angstrom Compact free electron Laser (SACLA) via trois sorties couplées par fibre avec un temps de retard de 200 ms entre chaque illumination et de 200 ms entre la dernière illumination et la sonde à rayons X, similaire à ce qui était utilisé précédemment pour s'adapter à la cinétique de l'accepteur quinone QA et QB et piloter efficacement les transitions d'état S4,6,55 . Nous avons mis en place un système de contrôle de rétroaction de la vitesse de la bande et du délai de dépôt, et le délai de clignotement et la phase des gouttelettes ont été ajustés en conséquence55. Pour obtenir des délais inférieurs à 200 ms entre l'illumination et la sonde à rayons X, un quatrième laser « à espace libre » a été utilisé. Il s'agissait soit d'un laser Opolette 355 LD (Opotek, longueur d'onde de 530 nm, largeur d'impulsion de 7 ns) sur l'instrument macromoléculaire de cristallographie femtoseconde/LCLS, soit d'un système laser NT230 OPO (longueur d'onde de 530 nm, largeur d'impulsion de 5 ns, EKSPLA Co .) chez SACLA. Ce laser en espace libre a été déclenché pour être synchronisé avec l'impulsion de rayons X avec un retard réglable qui a été réglé entre 50 et 4 000 μs pour cette étude. Le laser a été guidé avec des optiques vers le point d'interaction des rayons X, et sa position a été affinée pour chaque temps de retard afin de garantir que la position du point laser coïncide avec la position de la gouttelette d'échantillon au moment du retard sélectionné. Aux XFEL, une intensité lumineuse de 120 ± 10 mJ par cm2 a été appliquée car l'évolution de l'O2 s'est avérée saturée à 70 mJ par cm2 pour les dimensions et les concentrations des échantillons utilisés dans nos expériences4. Une intensité lumineuse de 120 mJ par cm2 correspond à environ 140 photons absorbés par monomère PS II dans la couche avant de 5 µm du cristal et à environ 9 photons par monomère PS II en supposant une épaisseur de cristal de 60 µm (qui est la limite supérieure de taille des cristaux utilisés dans cette étude) pour la couche arrière de 5 µm. Cette densité de photons assure une saturation sur tout le volume cristallin, même dans le cas de deux cristaux empilés l'un sur l'autre dans le faisceau laser. Étant donné une longueur d'impulsion minimale de 5 ns et 35 Chl par monomère PS II, l'intensité lumineuse utilisée est en moyenne de 0,8 photons par (Chl et nanoseconde) pour l'avant et de 0,05 photons par (Chl et nanoseconde) pour la partie arrière du cristal. Si un centre PS II subit une séparation de charge, les photons supplémentaires absorbés par l'antenne interne Chl sont rapidement dissipés sous forme de fluorescence avec une durée de vie moyenne de fluorescence d'environ 0,5 à 1 ns, empêchant ainsi toute surexcitation du centre de réaction ou provoquant tout échauffement. artefacts.

Les données de cristallographie ont été collectées dans diverses installations et les détails sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 2. Les conditions de faisceau expérimentales et les configurations de détecteur utilisées pour collecter chaque ensemble de données sont également tabulées. L'échantillon a été déposé dans la région d'interaction des rayons X à l'aide de la configuration Drop-on-Tape décrite précédemment55. Les conditions d'éclairage pour peupler différents états S sont détaillées dans la réf. 4.

Les données collectées pour les différents états d'éclairage ont été traitées à l'aide du programme dials.stills_process avec une cellule unitaire cible de a = 117,0 Å, b = 221,0 Å, c = 309,0 Å, α = β = γ = 90° et le groupe d'espace P212121 . Des taches de Bragg ont été intégrées au bord du détecteur. Une correction d'absorption Kapton due à la bande transporteuse de notre système de distribution d'échantillons a été appliquée à chaque spot de Bragg intégré, en tenant compte de la taille des gouttelettes, de l'épaisseur du ruban, de l'angle du ruban et de la position des taches de diffraction sur le détecteur par rapport à la position du cristal . Avant l'intégration, nous avons également effectué un raffinement d'ensemble des paramètres du cristal et du détecteur à l'aide du programme cctbx.xfel.stripe_experiment, dont il a été démontré qu'il rétrécit la distribution des cellules unitaires et améliore les cartes de différences isomorphes finales56. Enfin, les intensités ont été fusionnées à l'aide du programme cctbx.xfel.merge, qui applique une coupure de résolution par image et un filtrage des réseaux à l'aide d'un seuil de cellule unitaire de 1 % à partir du modèle de référence. Pour fusionner les réflexions, nous utilisons les bonnes pratiques décrites dans la réf. 57. Les cellules unitaires et le nombre de réseaux fusionnés pour chaque ensemble de données sont tabulés dans les tableaux de données étendus 1 et 2.

Les ensembles de données finaux fusionnés ont été acquis pour le 2F, 3F(50 µs), 3F(250 µs), 3F(500 µs), 3F(730 µs), 3F(1 200 µs), 3F(2 000 µs), 3F(4 000 µs) et les états 3F (200 ms) à des résolutions comprises entre 2,16 et 2,0 Å, obtenus en fusionnant entre 6 659 et 39 199 réseaux (tableaux de données étendus 1 et 2). Les ensembles de données fusionnés finaux avant la construction du modèle ont également été mis à l'échelle sur une base de bin de résolution à un ensemble de données de référence (dans ce cas, l'ensemble de données de référence est l'ensemble de données PS II publié dans le code d'identification PDB 7RF1)12. Cela nous permet d'effectuer une comparaison plus précise des cartes d'omission mFobs − DFcalc et des cartes 2mFobs − DFcalc entre différents ensembles de données.

Chaque ensemble de données a été affiné à l'aide d'une structure PS II haute résolution (1,89 Å) qui a été publiée dans un travail précédent (code ID PDB 7RF1)12 comme point de départ à l'aide du programme phenix.refine58. Le raffinement se fait en plusieurs étapes. Tout d'abord, les facteurs B du modèle de départ sont fixés à 30, et toutes les eaux et les atomes de l'OEC sont supprimés. Un raffinement initial du corps rigide couplé à un raffinement des coordonnées xyz et des facteurs B isotropes a été effectué pendant 15 cycles pour ajuster le modèle dans la cellule unitaire. Ensuite, les atomes OEC sont rajoutés et affinés avec des contraintes de liaison personnalisées pendant plusieurs cycles. Nous utilisons également des contraintes de liaison personnalisées pour la chlorophylle-a (pour permettre un placement correct du Mg par rapport au plan de l'anneau de porphyrine) et des ligands de type lipide inconnus (acide stérique) dans le raffinement. Après le raffinement initial du complexe OEC + protéine, des eaux ont été ajoutées au modèle à l'aide du protocole de prélèvement d'eau phenix.refine ainsi que du placement manuel des eaux via coot59 et de plusieurs cycles de raffinement.

À ce stade, nous avons divisé le modèle au voisinage de l'OEC et de l'OEC lui-même (uniquement les atomes de protéines et d'OEC) en plusieurs composants (Extended Data Table 3). La scission n'a été faite que dans les parties des chaînes A/a, C/c et D/d. La justification et la population des composants à chaque point temporel utilisé sont décrites dans la section Estimation de la distribution de la population à chaque point temporel. Dans chaque ensemble de données, le conformère primaire (défini comme l'intermédiaire qui progresse de S3 à S0) est affiné en utilisant une stratégie d'affinement réciproque xyz + facteur B isotrope. Pour les composants secondaires/tertiaires (dont les structures sont dites à l'état S3 ou S0), seuls les facteurs du groupe B sont ajustés (stratégie group_adp dans phenix.refine) pour les ajuster à la résolution du jeu de données. Pour la partie restante du modèle qui n'est pas divisée, un raffinement xyz réciproque régulier et un raffinement du facteur B isotrope sont effectués en tandem pour plusieurs cycles. Toutes les eaux (à l'exception des eaux terminales liées à l'OEC, c'est-à-dire W1 à W4) ont été raffinées en tant que composant unique.

Le raffinement de l'OEC dans le composant principal du modèle multicomposant a été effectué à l'aide de contraintes personnalisées qui ont été utilisées pour modéliser l'état S3. Cependant, pour tous les points dans le temps, nous avons utilisé des valeurs sd estimées légèrement plus lâches pour les contraintes (0,1 Å pour les liaisons, 10 ° pour les angles) pour permettre aux atomes OEC pendant le raffinement de se déplacer vers l'endroit où la densité électronique est modélisée de manière optimale et de réduire la contrainte dans le raffinement tout en conservant la forme générale de la grappe. L'OEC dans l'état S0 a été modélisé avec les contraintes utilisées pour notre structure d'état S0 précédemment publiée. Les contraintes utilisées pour modéliser les atomes OEC aux points temporels ont été fournies sous forme de fichiers texte (schémas 1 à 3 dans les données supplémentaires).

La distribution de la population à l'état S dans la transition S3 → S0 est une distribution hétérogène composée de (1) centres qui progressent de l'état S3 à S0, (2) centres qui sont en retard d'une transition et donc, progressent de l'état S3 à S0. État S2 à S3 et (3) centres qui sont passés à l'état S0. Alors que la majorité des centres sont en catégorie (1), en raison des inefficacités intrinsèques (« ratés ») du cycle de Kok dans PS II20, une certaine fraction des centres est en catégorie (2). De plus, après un certain temps dans la transition S3-S0, un nombre important de centres auront formé l'état S0 stable (catégorie (3)).

Dans ce contexte, il est important de tenir compte de cette hétérogénéité de population dans notre modélisation structurelle pour obtenir des cartes et des modèles de densité électronique précis. Pour ce faire, nous divisons notre modèle structurel près de la région du site actif (y compris l'OEC) en plusieurs composants. Le composant principal de chaque ensemble de données est la catégorie (1), qui est la transition intermédiaire de S3 à S0. La nature des composantes secondaires et tertiaires dépend de l'ensemble de données considéré. Dans chaque jeu de données, les coordonnées/facteurs B isotropes de la seule composante principale sont affinées (catégorie (1)). Les structures des composants secondaires et tertiaires sont modélisées à partir de structures connues ou précédemment déposées et ajustées uniquement pour la résolution à l'aide d'un raffinement du facteur B du groupe. L'identité du composant secondaire (et tertiaire s'il est utilisé) dépend du point dans le temps qui est traité. Par exemple, dans le jeu de données 3F(50 µs), un modèle à deux composants est construit avec les coordonnées du modèle 2F(50 µs)/facteurs B utilisés pour le composant secondaire. Dans les données 3F (1 200 µs), nous utilisons un modèle à trois composants, les composants secondaire et tertiaire étant les états S0 et S3. Les populations de chacun des composants aux différents points dans le temps sont données dans le tableau de données étendu 3. Nous avons utilisé les chiffres disponibles dans la littérature pour effectuer une analyse cinétique produisant une estimation de la répartition de la population. Étant donné que les populations inférieures à 10 % sont dans le niveau de bruit pour le raffinement structurel, nous avons ajusté nos populations pour éviter tout conformateur avec des populations aussi faibles.

La distribution de la population dans chacun des états S métastables a été précédemment déterminée à l'aide de la technique MIMS. Dans notre travail, l'état 2F de départ, qui est généré en éclairant avec deux lasers visibles avec un intervalle de flash de 200 ms, se compose d'environ 65 % d'état S3 et 35 % d'état S2 d'après des études menées sur des cristaux. Au troisième clignotement visible, la transition S3→S0 est initiée. Le lecteur est renvoyé aux données étendues dans la réf. 4 pour plus de détails sur la façon dont les populations d'état S pour chacun des états flash ont été estimées, en tenant compte des paramètres de manque calculés à partir des données XES et MIMS, et de la contre-illumination (ceci était négligeable à la vitesse de la bande et à la fréquence de dépôt de la gouttelette acoustique éjection qui a été utilisée dans la présente étude). Tous les résultats décrits dans cet article proviennent du monomère I (chaînes annotées en majuscules dans les structures publiées). Des tendances similaires sont observées pour le monomère II (chaînes annotées en minuscules).

La distance Mn1 – Mn4 reste allongée jusqu'à 3F (1 200 µs) dans l'intermédiaire subissant la transition S3 → S0, après quoi une diminution est observée dans les 3 ms suivantes. Nous avons testé la robustesse de la distance allongée à 3F (1 200 µs) en construisant une hypothèse alternative pour expliquer cette observation, en postulant qu'elle pourrait être due à deux populations distinctes dans la composante primaire : (1) augmentation de la distance Mn1–Mn4 due aux ratés qui forment S3 supplémentaire ou (2) distance Mn1–Mn4 diminuée (avec/sans disparition de Ox) qui est une propriété de l'intermédiaire subissant la transition S3→S0. Nous avons modélisé ce scénario en augmentant la population S3 de 35 à 55 % et en diminuant la composante primaire (avec/sans Ox) de 40 à 20 % au point temporel 3F (1 200 µs). Le raffinement résultant a donné des distances Mn1–Mn4 de 5,14 Å (avec Ox) et 5,09 Å (sans Ox). Les deux nombres sont similaires à la distance donnée à la Fig. 3 et à l'intérieur de l'erreur de mesure. Les tests ne montrent donc aucune contraction par rapport à l'état S3 et permettent de rejeter l'hypothèse. Nous réitérons que l'estimation de la population S3 de 35 % au point temporel 3F (1 200 µs) est bien établie à l'aide de plusieurs expériences indépendantes, comme détaillé dans la section précédente et les publications antérieures.

Pour estimer la précision de position des atomes OEC et des acides aminés environnants pour chaque instant, nous avons utilisé la procédure END/RAPID60, similaire à ce qui était précédemment employé6. En bref, dans cette méthode, nous perturbons les facteurs de structure d'une quantité aléatoire entre ± (mFobs - DFcalc). Les coordonnées atomiques du modèle final pour ce point dans le temps sont également légèrement perturbées pour permettre au modèle d'explorer un plus grand espace de phase (seul le conformère primaire est perturbé). Par la suite, 100 de ces ensembles de données synthétiques sont générés pour chaque point dans le temps, et ils sont ensuite raffinés chacun séparément. À partir de l'ensemble de ces ensembles de données raffinés, nous pouvons estimer l'erreur associée à la métrique de distance d'intérêt. Les erreurs obtenues doivent être considérées comme une limite supérieure car les perturbations introduites dans les facteurs de structure sont une surestimation des erreurs réelles dans l'expérience.

Les détails de mise en œuvre peuvent être trouvés sur https://bl831.als.lbl.gov/END/RAPID/end.rapid/Documentation/end.rapid.Manual.htm.

Toutes les cartes d'omission mFobs − DFcalc présentées dans le manuscrit ont été générées à l'aide du programme phenix.polder et en utilisant les coefficients de carte d'omission normaux du fichier output.mtz (et non les coefficients de carte de polder)61. Pour le calcul de la hauteur de pic, où qu'il soit indiqué, nous avons utilisé des scripts python personnalisés qui font la moyenne de la valeur mFobs - DFcalc omit map sur un rayon de 0,5 Å de l'atome d'intérêt.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques et les facteurs de structure ont été déposés dans la Protein Data Bank, www.pdb.org (codes PDB 8EZ5 pour les données 2F ; 8F4D pour les données 3F(50 μs) ; 8F4E pour les données 3F(250 μs) ; 8F4F pour les données 3F(500 μs); 8F4G pour les données 3F(730 μs); 8F4H pour les données 3F(1 200 μs); 8F4I pour les données 3F(2 000 μs); 8F4J pour les données 3F(4 000 μs); 8F4K pour les données 3F (200 ms) et 8F4C pour les données alternatives 2F). Les données brutes du laser à électrons libres de rayons X ont été déposées dans la base de données Coherent X-Ray Imaging, www.cxidb.org (ID 215).

Les programmes open source dials.stills_process, cctbx.xfel GUI, cctbx.xfel.stripe_experiment, cctbx.xfel.merge et le programme hérité cxi.merge sont distribués avec les packages DIALS disponibles sur http://dials.github.io. Les instructions et les détails pour l'utilisation de ces programmes peuvent être trouvés dans les réf. 56,57 avec une documentation supplémentaire disponible sur http://cci.lbl.gov/xfel. Les figures présentées dans l'article ont été rendues à l'aide du logiciel PyMOL v.2.5 (réf. 62). Le code personnalisé utilisé pour calculer les valeurs de hauteur de pic est accessible au public sur https://github.com/asmit3/eden(réf. 63).

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Nous remercions K. Sauer (1931-2022) pour son intérêt pour cette recherche et pour de nombreuses discussions sur l'oxydation photosynthétique de l'eau. Nous remercions R. Massad, M. Kretzschmar, P. Sinnott, J. Blaschke, A. Britz, S. Carbajo, C. de Lichtenberg, L.-C. Kao, L. Lassalle, D. Liebschner, D. Mendez, F. Moss, E. Pastor, C. Pham, B. Poon, KD Sutherlin et ID Young pour leur soutien lors de la préparation des échantillons, de la collecte et du traitement des données. Nous remercions le personnel de soutien de LCLS/SLAC, SACLA/Japon, SSRL et ALS. Ce travail a été soutenu par le directeur, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences (OBES), Division of Chemical Sciences, Geosciences, and Biosciences of the Department of Energy (DOE) (JY, VKY and JK) for X-ray spectroscopy et la collecte et l'analyse de données de cristallographie, et le développement de méthodes pour les systèmes photosynthétiques ont été soutenus par les National Institutes of Health (NIH ; subventions GM055302 (VKY) pour la biochimie du photosystème II, GM110501 (JY) et GM126289 (JK) pour le développement d'instruments pour les rayons X expériences laser à électrons libres (XFEL) et GM117126 (NKS) pour le développement de protocoles de calcul pour les données XFEL). NKS reconnaît le soutien du projet Exascale Computing (subvention 17-SC20-SC), un effort de collaboration du DOE Office of Science et de la National Nuclear Security Administration. Stratégie d'excellence allemande (projet EXC 2008/1-390540038 (AZ, HD et SH)) coordonné par TU Berlin et la Fondation allemande pour la recherche via le Centre de recherche collaborative SFB1078 (Humboldt Universität zu Berlin), TP A5 (AZ, HD, MI, RH et JG) et Vetenskapsrådet (subventions 2016-05183 (JM) et 2020-03809 (JM)) ainsi qu'Energimyndigheten (subvention 45421-1 (JM)) sont reconnus pour leur soutien. RH reconnaît le soutien d'un Caroline von Humboldt Stipendium, Humboldt Universität zu Berlin. CJK reconnaît le soutien du NIH (bourse de recherche NRSA F32GM142218). Cette recherche a utilisé les ressources du NERSC, une installation utilisateur soutenue par l'Office of Science, DOE (contrat DE-AC02-05CH11231). Les données XFEL ont été recueillies au LCLS/SLAC, Stanford et SACLA, Japon. Les expériences XFEL au SACLA ont été réalisées au BL2 avec l'approbation du Japan Synchrotron Radiation Research Institute (propositions 2018B8089, 2019A8081 et 2019B8067). Les tests des cristaux et de diverses parties de la configuration ont été effectués dans des installations synchrotron fournies par l'ALS à Berkeley et la SSRL à Stanford, financées par le DOE OBES. Le programme de biologie moléculaire structurale SSRL est soutenu par le DOE OBER et le NIH (subvention P41GM103393). L'utilisation du LCLS et du SSRL, le SLAC National Accelerator Laboratory est soutenu par le DOE, Office of Science, OBES (contrat DE-AC02-76SF00515), et les travaux de biologie structurale au LCLS sont soutenus par le NIH (subvention P41GM139687 ; le détecteur Rayonix a été financé par la subvention S10 OD023453).

Mohamed Ibrahim

Adresse actuelle : Institut de médecine moléculaire, Université de Lübeck, Lübeck, Allemagne

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Asmit Bhowmick, Rana Hussein, Isabel Bogacz, Philipp S. Simon

Division de biophysique moléculaire et de bioimagerie intégrée, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, Californie, États-Unis

Asmit Bhowmick, Isabel Bogacz, Philipp S. Simon, Ruchira Chatterjee, Margaret D. Doyle, In-Sik Kim, Hiroki Makita, Medhanjali Dasgupta, Corey J. Kaminsky, Miao Zhang, Isabela I. Nangca, Stephen M. Keable, James M .Holton, Daniel W. Paley, Nigel W. Moriarty, Paul D. Adams, Aaron S. Brewster, Nicholas K. Sauter, Jan Kern, Junko Yano et Vittal K. Yachandra

Département de biologie, Université Humboldt de Berlin, Berlin, Allemagne

Rana Hussein, Mohamed Ibrahim, Julia Gätcke, Stephanie Haupt, Holger Dobbek & Athina Zouni

Biomimétique moléculaire, Département de chimie — Ångström, Université d'Uppsala, Uppsala, Suède

Mun Hon Cheah, Petko Chernev, A. Orkun Aydin, Fikret Mamedov et Johannes Messinger

Département de chimie théorique et de biologie, KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Suède

Thomas Fransson

Institut japonais de recherche sur le rayonnement synchrotron, Hyogo, Japon

Kensuke Tono et Shigeki Owada

Centre RIKEN SPring-8, Hyogo, Japon

Kensuke Tono et Shigeki Owada

Linac Coherent Light Source, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, Californie, États-Unis

Leland B. Gee, Franklin D. Fuller, Alexander Batyuk et Roberto Alonso-Mori

Département de biochimie et de biophysique, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

James M. Holton

SSRL, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, Californie, États-Unis

James M. Holton

Département de bioingénierie, Université de Californie, Berkeley, Californie, États-Unis

Paul D.Adams

Département de physique, Université du Wisconsin-Madison, Madison, WI, États-Unis

Uwe Bergmann

Département de chimie, Université d'Umeå, Umeå, Suède

Johannes Messinger

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RA-.M., NKS, UB, AZ, JM, JK, JY et VKY ont conçu l'expérience. Échantillons préparés RH, MI, RC, MD, MZ, JG, SH, IIN, AZ et JK. RC, MHC, TF, JG, SH, AOA et FM ont caractérisé l'activité des échantillons. KT, SO, LBG, FDF, A.Batyuk et RA-.M. préparé et exploité les lignes de faisceau laser à électrons libres de rayons X (XFEL). IB, PSS, PC, I.-SK, HM, FDF et JK ont développé, testé et géré le système de distribution d'échantillons. A.Bhowmick, RH, IB, PSS, MI, RC, MDD, MHC, TF, PC, I.-SK, HM, MD, CJK, MZ, JG, SH, SMK, KT, SO, LBG, FDF, A .Batyuk, RA-.M., DWP, ASB, NKS, UB, AZ, JM, JK, JY et VKY ont réalisé l'expérience XFEL. A.Bhowmick, JMH, DWP, NWM, PDA, ASB et NKS ont développé de nouveaux logiciels pour le traitement des données. A.Bhowmick, MD, SMK, DWP, ASB et NKS ont traité les données XFEL. A.Bhowmick, RH, IB, PSS, MI, MDD, HD, NKS, AZ, JM, JK, JY et VKY ont analysé et interprété les données. A.Bhowmick, RH, IB, PSS, MDD, AZ, JM, JK, VKY et JY ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Athina Zouni, Johannes Messinger, Junko Yano ou Vittal K. Yachandra.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Richard Neutze, Dimitrios Pantazis et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Pour la comparaison du niveau de hauteur du pic, la carte d'omission de l'atome d'oxygène, O2, est également affichée. Les cartes d'omission pour chaque atome ont été générées en omettant individuellement l'atome uniquement dans le conformère primaire de chaque ensemble de données. Les cartes sont présentées aux niveaux de contour de 2,5, 3 et 4σ. (a) Omettre les cartes de OX, O5 et O2 (b) Omettre les cartes de W1, W2, W3, W4 et O2. Une nette réduction de la hauteur du pic de carte d'omission de OX, O5, W1, W2, W3, W4 est observée par rapport à la carte d'omission de référence O2 entre 730 et 2000 µs.

La carte est représentée à un niveau de contour de 2,5σ (en jaune). La densité électronique est observée à ce niveau entre W3 et W4 (voir flèche rouge), indiquant peut-être un mouvement transitoire de l'eau qui a également été corroboré par le chevauchement des densités de la carte d'omission. À des fins de comparaison, les cartes d'omission individuelles de W3 et W4 sont également superposées à 2,5, 3 et 4σ (schéma de couleurs identique à celui de la Fig. 2 dans le texte principal). Une densité électronique plus forte est également observée autour de W1/D61, éventuellement liée à un mouvement impliquant un transfert de protons, comme indiqué dans le texte principal lié à la Fig. 2. La densité électronique autour de O1 est peut-être liée aux changements observés dans W26-W30 (appelés la région de la «roue hydraulique») à ce moment (discuté dans le texte principal lié à la Fig. 4).

La distribution du facteur B de toutes les eaux du canal est superposée pour chaque point dans le temps à des fins de comparaison. Les valeurs de l'axe y des points marqueurs pour les 4 eaux ne sont que des espaces réservés. Il y a un décalage important dans les valeurs relatives du facteur B de W27, W28 et W32 au point temporel 3F (1200 µs) qui coïncide avec la disparition de OX.

Tableaux supplémentaires 1 et 2.

Ce dossier compressé contient les schémas supplémentaires 1 à 3 : contraintes utilisées pour modéliser l'OEC dans la transition S3→S0.

Vidéo montrant les différents changements à l'OEC dans la transition S3→S0. Version haute résolution disponible sur : https://drive.google.com/file/d/1d4fMKBcYUdenqajlXo3J-a8lU5eaUxe3/view?usp=share_link.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui autorise l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Bhowmick, A., Hussein, R., Bogacz, I. et al. Preuve structurelle des intermédiaires lors de la formation d'O2 dans le photosystème II. Nature 617, 629–636 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06038-z

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Reçu : 18 novembre 2022

Accepté : 31 mars 2023

Publié: 03 mai 2023

Date d'émission : 18 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-06038-z

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Nature (2023)

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